微波辐照对干酪乳杆菌高产L-乳酸的诱变效应

徐伟 王鹏 张兴
[1]哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090 [2]哈尔滨商业大学食品科学与工程学院,哈尔滨150076

文章摘要:在低功率微波条件下，并采用水循环（20℃）冷却装置，对于酪乳杆菌鼠李糖亚种（Lactobacillus casei subsp．rhamnosus）CICC6013进行诱变处理，通过对微波辐照功率和微波辐照时间做单因素平行实验，得到最高产酸量为124．15g／L的突变株W4—23，比原始菌株产酸发酵量提高了53．45％，连续遗传8代，产酸性状稳定。研究结果表明，最佳诱变条件为在400W微波功率下辐照20min。
文章主题:微波辐照 诱变效应 干酪乳杆菌 L-乳酸

文章内容：第25卷第5期2007年10月辐射研究与辐射工艺学报.....1-25..5207微波辐照对干酪乳杆菌高产.乳酸的诱变效应徐伟,王鹏张兴(哈尔滨工业大学市政环境工程学院哈尔滨150090)(哈尔滨商业大学食品科学与工程学院哈尔滨150076)摘要在低功率微波条件下,并采用水循环(20(2)冷却装置,对于酪乳杆菌鼠李糖亚种(.)6013进行诱变处理,通过对微波辐照功率和微波辐照时间做单因素平行实验,得到最高产酸量为124.15的突变株4—23,比原始菌株产酸发酵量提高了53.45%,连续遗传8代,产酸性状稳定.研究结果表明,最佳诱变条件为在400微波功率下辐照20.关键词微波辐照,诱变效应,干酪乳杆菌,酸中图分类号939.117,684优良的工业菌种是发酵工业的核心.发酵法生产_乳酸至今仍是国际上获得_乳酸的主要生产方法.我国主要以米根霉发酵生产哥酸,发酵过程好氧,能耗高,而国外主要以细菌为生产乳酸的菌种.因而高产_乳酸细菌的育种工作具有重要的意义.诱变育种是大多数工业微生物育种重要且有效的技术【】.基因工程育种较为复杂,目前还难以像诱变育种那样得到普遍应用;物理诱变国内外应用较广泛的是紫外线,射线和射线.随着这些诱变剂的反复使用,很多工业生产菌株对其产生了耐受性.因此,许多学者尝试应用一些新型物理诱变方法,如离子注入,激光,微波等.微波()即指波长从1～1,频率从300一300的超高频电磁波.微波最早应用在军事通讯领域,20世纪40年代后期逐渐应用于工业,农业,医疗,科研等领域,微波在生物学上主要用于杀菌,刺激植物种子发芽生长,用于工业微生物诱变育种报道不是很多.微波辐照诱变微生物菌种,有着传统诱变法不具备的优势,具有清洁,高效,设备简单,方法易行,正突变率高,突变菌株性状稳定等优点【6】,克服了紫外诱变易产生光修复现象的缺点.本研究以干酪乳杆菌鼠李糖亚种(.)为出发菌株,采用可连续变功率的微波设备,在低功率,长时间的辐照下获得高产诱变菌株.1材料和方法1.1培养基培养基¨.1.1.1种子培养基(/)葡萄糖50,蛋白胨10,酵母膏10,乙酸钠0.5,柠檬酸二铵0.2,240.2,4?7200.2,4?4200.01,4?7200.01,灭菌前6.5.1.1,2发酵培养基(/)葡萄糖150,蛋白胨10,酵母膏10,乙酸钠0.5,柠檬酸二铵0.2,240.2,4"7200.2,44200.01,4?7200.01,灭菌前6.5.1.1.3溴甲酚紫一碳酸钙平板培养基(/)固体培养基加入35,1.6%溴甲酚紫1.4.以上培养基灭菌条件均为121,20.1.2出发菌株的驯化1.2.1出发菌株干酪乳杆菌鼠李糖亚种(.)6013,已证实干酪乳杆菌其产物为光学纯度95%以上的哥酸.将出发菌株活化,然后用培养基进行多次培养基驯化,使出发菌株的乳酸产量为80.9/.1.3微波诱变装置目前进行微波育种的研究人员,普遍采用普通国家自然科学基金项目(50778053)资助第一作者:徐伟,女1963年10月出生,2001年毕业于哈尔滨工业大学,硕士,现为哈尔滨工业大学2005级(春)博士研究生在读,环境工程专业通讯联系人:王鹏收稿日期:初稿2007—04—16,修回2007—07—17第5期徐伟等:微波辐照对干酪乳杆菌高产-乳酸的诱变效应317的家用微波炉设备,存在功率不能连续可调的问题.在高功率微波辐照条件下,由于微波产生的热效应,会使种子在短时问内达到的热致死率很高,正突变率低,微波导致的基因性状突变难以充分显现.实验在改装的家用微波炉中完成,改造后的微波炉实现了微波功率在0—700内连续输出,微波频率为2450.为防止诱变过程中菌体温度过高导致乳酸菌大量死亡,采用自行设计的水循环冷却装置隅对菌悬液温度加以调控,保持在微波连续辐照过程中菌悬液温度恒定在低温,以实现对出发菌株的低功率长时问连续辐照,使其可以接受到造成足够损伤的微波诱变剂量.本次实验中保持循环水的温度为20℃.1.4微波辐照诱变方法1.4.1茵悬液的制备及诱变方法参见文献【9].1.4.2初筛和复筛将诱变处理后的菌液接人20液体培养基,培养12,然后取进行适当稀释,涂布于溴甲酚紫一碳酸钙分离平板上,37静置培养48后,将产生较大变色圈和透明圈或发生形态变化的菌落转接至斜面.37培养36,放人冰箱中保藏.将斜面保藏菌株挑取1环接人10液体培养基中,在温度37培养24,取1也培养液接人10种子培养基中,在温度37,培养40后再接人发酵培养基中,进行发酵实验,测乳酸含量,选择优良菌株.1.5分析方法发酵液@酸含量的测定采用定钙法.2结果2.1不同微波辐照功率对乳酸细菌诱变结果实验在低功率条件下对菌体进行辐照,并采用水循环冷却试管中的菌悬液,固定微波辐照时问为15,考察微波辐照功率对乳酸细菌诱变效果的影响.从实验各剂量组分别挑取30株菌株进行发酵产酸实验,测乳酸含量.统计各剂量组相对未照射组菌株产酸能力超过5%以上,+%以内及一5%以下菌株数,计算各水平段菌株百分数.结果如表1和图1一图3所示.1.15/%0.110015.0.240015如∞如∞如∞∞如∞如加0-嚣,10一如∞如加∞如∞∞∞如们如加0318辐射研究与辐射工艺学报第25卷..370015结果表明,在辐照时间15条件下,突变率随微波辐照功率的增加而增加,在功率为400时正突变率达最高;可得到产酸量为116.25/的3—6和120.76/的3—20,分别较未照射组(平均乳酸产量为80.9/)提高了43.70%和49.27%.在辐照时间15,微波辐照功率250条件下,得到产酸量为117.15的2—3和118.05/的2—29,分别较未照射组提高了44.81%和45.92%;在微波辐照功率550条件下,得到产酸量为124.15/的4—23,较未照射组提高了53.45%;在微波辐照功率700条件下,得到产酸量为116.76/的5一6,较未照射组提高了44.32%.2.2不同辐照时间对乳酸细菌诱变结果实验在微波辐照功率为