微囊化人头皮毛乳头细胞移植诱导毛发形成

李宇 李国强 蔡湘娜 林常敏
汕头大学医学院第一附属医院整形美容外科、组织工程实验室,汕头515041

文章摘要:目的探索微囊化人头皮毛乳头细胞（以下简称毛乳头细胞）对裸鼠背部皮肤毛囊形成的诱导作用。方法胶原酶消化法体外分离、培养毛乳头细胞，再将毛乳头细胞以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine—alginate，APA）微囊包裹，以胶原凝胶作为载体，植入裸鼠背部皮下；移植空囊、游离毛乳头细胞各作为对照。观察移植部位毛发生长情况，利用组织学方法观测所形成的毛囊结构。结果微囊化毛乳头细胞皮下移植4周后，裸鼠背部移植区有白色、浓密、分布均匀的毛发长出。局部组织切片见大量发育完整的毛囊结构；而空囊及游离毛乳头细胞移植均未能诱导出上述现象。结论聚集性生长的微囊化毛乳头细胞能够保持诱导皮肤毛囊形成的作用，且这种作用无种属特异性。
文章主题:毛乳头细胞 毛囊 移植

文章内容：12卷第6期&;,—2006,—1.12,.6医微囊化人头皮毛乳头细胞移植诱导毛发形成李宇李国强蔡湘娜林常敏?实验研究?【摘要】目的探索微曩化人头皮毛乳头细胞(以下简称毛乳头细胞)对裸鼠背部皮肤毛囊形成的诱导作用.方法胶原酶消化法体外分离,培养毛乳头细胞,再将毛乳头细胞以海藻酸钠一多聚赖氨酸一海藻酸钠(1-11—,)微囊包裹,以胶原凝胶作为载体,植入裸鼠背部皮下;移植空囊,游离毛乳头细胞各作为对照.观察移植部位毛发生长情况,利用组织学方法观测所形成的毛囊结构.结果微囊化毛乳头细胞皮下移植4周后,裸鼠背部移植区有白色,浓密,分布均匀的毛发长出.局部组织切片见大量发育完整的毛囊结构;而空囊及游离毛乳头细胞移植均未能诱导出上述现象.结论聚集性生长的微囊化毛乳头细胞能够保持诱导皮肤毛囊形成的作用,且这种作用无种属特异性.【关键词】毛乳头细胞;毛囊;移植,,,—.('—,,,,55041.[]111.().——().,11.1.1,,,1.—.,.1(—),.[];;人头皮毛乳头细胞(以下简称毛乳头细胞)在毛囊的形态学发生及其周期性生长调控中处于中心环节,其显着的生物学特性为体内,外表现凝集性的生长方式,及体内,外具有诱导毛囊形成的能力.有研究证实:毛乳头细胞与毛囊上皮细胞在裸鼠体内相互作用,能形成毛囊样结构,并促进其毛发的形成.毛乳头细胞的这种诱导特性并无明显的种属特异性.国外学者的研究发现,被移植的毛乳头细胞在受体内需聚集成毛乳头样的聚集团后,才能发挥其诱导毛囊形成的功能【.在以往的实验中,我基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30170973);广东省自然科学基金资助项目(编号:06033496)作者单位:515041汕头,汕头大学医学院第一附属医院整形美容外科,组织工程实验室[李宇(:@..)]■们发现,以微囊化技术包裹游离的毛乳头细胞后,微囊可以为包裹于其中的细胞提供立体生长的空问,细胞得以聚集性的方式生长,故有利于毛乳头细胞充分地发挥其诱导毛囊形成,维持毛发生长的作用.为了进一步证实上述观点,我们建立评价毛乳头细胞诱导功能的模型,并以裸鼠为研究对象,观察微囊化毛乳头细胞对裸鼠皮肤毛囊形成的诱导作用.材料与方法一,材料1.动物:6～8周龄无特定病原体()裸小鼠(/)12只,体质量25～28,雌雄不拘,由中山大学医学院实验动物中心提供(实验动物合格证号为2003077).层流裸鼠室条件下饲养,恒温25℃,恒湿75.2006年12月第12卷第6期』!垒!!坠!!!!!2.主要试剂和仪器:改良依格尔动物细胞培养基(),胶原酶,胎牛血清,海藻酸钠,多聚赖氨酸(相对分子量为1500030000)均购自公司;氯化钙为国产分析纯;高压电场微囊发生器(上海理工大学).二,方法1.分组:随机将裸小鼠分为3组,每组4只.(1)毛乳头细胞微囊+凝胶组:将毛乳头细胞微囊化后,以胶原凝胶作为载体,移植入裸鼠背部皮下.(2)空囊组:移植物为中空微囊(微囊内不包含任何细胞).(3)毛乳头细胞组:移植物为游离毛乳头细胞,将细胞悬液注入裸鼠背部皮下.2.毛乳头细胞的培养:标本采白头皮外伤清创缝合术修剪创缘所得的正常头皮.患者均为男性,年龄12～35岁.采用"一步酶消化法"分离毛乳头细胞,在含5%的孵箱中培养.细胞融合后传代,取第3代细胞进行实验.3.毛乳头细胞微囊化:参考0等的方法制备海藻酸钠一多聚赖氨酸一海藻酸钠(——,)微囊.主要步骤为:将毛乳头细胞用0.25胰蛋白酶消化成单细胞,混悬于20/的海藻酸钠溶液中,细胞浓度为5×10个/,经高压电场微囊发生器滴人11/的氯化钙溶液中,形成微胶球,生理盐水清洗3次;于1/多聚赖氨酸溶液中作用10,生理盐水清洗3次;2/海藻酸钠溶液中作用4,生理盐水清洗3次,每次3;0.05/枸橼酸钠溶液中作用6,以液化微囊中心,生理盐水清洗3次,每次3.将毛乳头细胞微囊转入(含15胎牛血清)中培养,备用.4.制备鼠尾胶原:分离2鼠尾腱,溶于200已消毒的3醋酸溶液中,4冰箱中保存,不时搅拌.48后,以4000/的转速,4℃离心半小时,收集上清液,一20.冰箱中保存备用.5.制备毛乳头细胞微囊凝胶7]:吸取鼠尾胶原4,加入浓缩10倍的培养液0.5,及1/的0.5,低温下混匀后,加入已铺有毛乳头细胞微囊的小培养皿中,将胶原铺满整个皿底.置于37℃温箱中1,胶原凝固后,加入少量培养液,37培养箱中培养,待用.同法制备空微囊凝胶.6.裸鼠移植:将裸鼠以氯胺酮常规麻醉后,在其背部皮肤中央剪开长约1的小口,钝性分离皮下组织形成小囊后,将含有毛乳头细胞微囊的凝胶块剪成约1×1左右的小块,植入小囊,缝合切=1.同法完成空囊对照组的移植.游离毛乳头细胞组的移植采用注射器,直接将细胞混悬液注入裸鼠背部皮下.7.组织学检测:分别于移植后第2,4,6,8周,切取移植部位皮肤,常规固定,脱水,石蜡包埋,切片,苏木精一伊红()染色后,光镜下观察裸鼠皮肤的组织学改变.部分标本以戊二醛固定,常规包埋,电镜下观察其超微结构.结果一,毛发生长微囊化毛乳头细胞移植裸鼠4只,4周后,只有3只裸鼠背部皮肤的移植区域有白色毛发长出(图1,另一只仅出现稀疏的微小绒毛).第5周毛发生长旺盛,浓密,且其分布间隙均匀,自然;靠近移植部位周围亦有稍显稀疏的毛发生长.第6周毛发开始脱落,其中移植部位周围的毛发较早脱落.第8周时,移植部位仍有少量稀疏毛发存在.而对照组中,空囊及游离毛乳头细胞移植8周后,均未见移植区有毛发生长现象.二,组织学改变微囊化毛乳头细胞移植4周后,局部组织切片染色后,光镜下可见大量呈同心圆排列的毛囊结构,其中由内向外分别为:毛根,内根鞘,外根鞘,真皮鞘(图2).在空囊及游离毛乳头细胞移植组的组织切片中,始终未发现完整的形成毛囊结构(图3,4).讨论一,毛乳头细胞具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的作用在胚胎发育过程中,呈凝集性生长的真皮成纤维细胞诱导了毛囊的形态学发生,这些凝集的细胞产生多种针对表皮发育的调节因子和信号,从而导致表皮细胞增生