一种快速、经济、省时的施万细胞体外培养和纯化方法

张雪宝 曾园山 陈穗君
中山大学中山医学院组织学胚胎学教研室,神经科学研究室,广州510080

文章摘要:目的探讨一种快速、简单、经济的施万细胞（SCs）培养和纯化方法，为SCs体内移植研究提供稳定及可靠的细胞来源。方法选用SD乳鼠，取坐骨神经和臂丛神经，用单细胞双酶消化法和半植块单酶消化法培养SCs。结果用同样多的组织材料，半植块单酶消化法所获得的SCs比单细胞双酶消化法所获细胞至少多两倍，省时40min。免疫组织化学染色显示，获得的施万细胞96％以上呈S-100阳性。结论用半植块单酶消化法培养SCs，可以在短时间内获得足够数量和足够纯度的SCs。
文章主题:施万细胞 细胞培养 单酶消化法 大鼠

文章内容：第38卷第5期2007年1月解剖学报1.38,.5.27?技术方法?一种快速,经济,省时的施万细胞体外培养和纯化方法张雪宝曾园山陈穗君(中山大学中山医学院组织学胚胎学教研室,神经科学研究室,广州510080)【摘要]目的探讨一种快速,简单,经济的施万细胞()培养和纯化方法,为体内移植研究提供稳定及可靠的细胞来源.方法选用乳鼠,取坐骨神经和臂丛神经,用单细胞双酶消化法和半植块单酶消化法培养.结果用同样多的组织材料,半植块单酶消化法所获得的比单细胞双酶消化法所获细胞至少多两倍,省时40.免疫组织化学染色显示,获得的施万细胞96%以上呈-100阳性.结论用半植块单酶消化法培养,可以在短时间内获得足够数量和足够纯度的.[关键词]施万细胞;细胞培养;单酶消化法;大鼠[中图分类号]322.8[文献标识码][文章编号]0529—1356(207)05.628.ⅱⅱⅱ￡ⅳ豫—,—,—(,,,-,510080,)],()0..$.35-—.,(—)(1)40.96%-100.(—),.[];;;施万细胞(,)是周围神经系统的一种神经胶质细胞,是由(1939)首先发现,它包绕在周围神经的轴突周围,形成髓鞘或不形成髓鞘.尽管成年哺乳动物中枢神经受损伤的轴突欠缺再生能力,但周围神经受损伤的轴突再生能力却较为强大.有学者认为,这种轴突再生能力的差异是因为中枢神经自身的微环境不适宜轴突再生….进一步研究表明,将周围神经移植至中枢神经后,轴突能再生长入周围神经内,而起关键作用的成分正是.目前,的分离,培养技术已基[收稿日期][基金项目][作者简介]2006.06.27[修回日期]2006.09.25国家自然科学基金资助项目(30270700);广东省社会发展攻关项目(200333808)张雪宝(1977一),女(汉族),陕西省三原县人,医学博士.*通讯作者()-:@...:(020)87331452本成熟,但其培养过程复杂,耗时而又耗资,所以仍需要不断完善.本研究试图探讨一种快速,简单,经济而又能得到足够纯度和数量的的培养方法,为体内移植研究提供稳定及可靠的细胞来源.材料和方法1.材料新生大鼠(生后3～5),由中山大学实验动物中心提供./12培养基购自公司,,牛垂体提取液,多聚赖氨酸,胰蛋白酶和ⅳ型胶原酶购于公司,胎牛血清()购于四季青公司,兔抗大鼠一100多克隆抗体(工作浓度为1:100),免疫细胞化学试剂盒,显色试剂盒购于博士德公司.2.的体外培养,纯化及鉴定选用生后3～5的新生大鼠6只,分为两组,每组3只.在无菌条件下断头,取臂丛神经和坐骨神张雪宝等.一种快速,经济,省时的施万细胞体外培养和纯化方法经置于冷的.液中,在解剖显微镜下剥去神经外膜,剪碎至23大小,置人离心管中.1000/离心5,弃上清.第1组为单细胞双酶消化培养法:加入0.16%型胶原酶消化20(37=),离心弃上清,再用0.25%胰蛋白酶消化10,用终止消化.离心弃上清,加入.液吹打成细胞悬液.用200目滤器过滤,离心弃上清,随后加入含10%,2/和20/牛垂体提取液的/12培养液.细胞计数后制成1×5/单细胞悬液移人经多聚赖氨酸铺板的培养瓶,于37=,5%培养箱中进行培养.10后将未贴壁的细胞移人另1培养瓶,再过10重复1次.细胞每3更换培养液.当细胞长至90%以上时用0.25%胰蛋白酶消化进行细胞传代.第2组为半植块单酶消化培养法:在剪碎的组织块内加入0.16%型胶原酶37℃消化20,离心弃上清,用.液洗3遍.随后用少量含10%,2/和20/牛垂体提取液的/12培养液重新悬浮细胞.再将细胞悬液移人经多聚赖氨酸铺板的培养瓶中,于37=,5%,培养箱中进行培养,培养后再补加至足量培养液.细胞每3更换培养液.当细胞长至90%以上时进行细胞传代,用0.125%的胰蛋白酶差速消化,并视具体情况行双10差速贴壁,进一步纯化施万细胞.取部分细胞进行.100免疫细胞化学鉴定,方法如下:(1)弃去旧培养液,用0.01/洗3次,每次5,以4%多聚甲醛固定10,0.01/洗3次,每次5.(2)0.3%,,封闭内源性过氧化物酶10,0.01/洗3次,每次5.(3)1:10正常山羊血清封闭20,甩去血清,不洗,加.100一抗(1:100).阴性对照只加代替一抗,4=过夜.(4)0.01/洗3次,每次5,加生物素化二抗,37=孵育30.(5)0.01/洗3次,每次5,加复合液,37=孵育30.(6)0.01/洗3次,每次5,显色5—10.(7)双蒸水洗3次,每次5,终止反应.(8)光镜下观察阳性染色细胞,并随机选取5个0×20的视野,计数阳性细胞所占的百分比数目.结果第1组单细胞双酶消化法用新生大鼠3只,可用25培养瓶接种1瓶细胞.倒置显微镜下观察,所得细胞为分散的小圆形细胞.接种24后观察,少量细胞漂浮死亡,大量细胞已贴壁,并长出突起.培养4—6后,细胞间排列较疏松,多数呈星网状排列,少量排列成栅栏样(图1).第2组半植块单酶消化法用新生大鼠3只,可用25培养瓶接种2瓶细胞.比第1组省时至少40.倒置显微镜下观察,原代培养细胞为少量小圆形细胞及大量未完全酶消化的细小组织块.接种后组织块已贴壁,接种24后,有较多细胞从细小组织块周围呈辐射状爬出,并长出突起.4—6即可融合,细胞间排列紧密,多呈栅栏样或旋涡样排列(图2).倒置显微镜下观察,两组培养瓶内均可见到两种细胞.第1种细胞较小,呈具有两个长突起的双极梭形,也有少数细胞呈具有3个长突起的三角形,胞体边缘有亮晕(图1).第2种细胞较大,呈扁平不规则形,有多个短小的突起,胞体边缘没有呈现亮晕(图1)..100免疫细胞化学染色结果显示,阳性细胞呈棕黄色染色,胞体小,有细长双极或三极突起,胞体轮廓清晰呈卵圆形,与在倒置显微镜下所观察到的第1种细胞的形态相类似(图3,4),表明是施万细胞.那些扁形而又不规则形态的细胞则呈免疫细胞化学染色阴性,提示是成纤维细胞.经计数施万细胞得出其纯度可达96%.讨论体外培养施万细胞的组织来源以坐骨神经和臂丛神经最