耳霉属真菌耐热性高活力碱性蛋白酶
文章内容：;/,耳霉属真菌耐热性高活力碱性蛋白酶..等一,前言蛋白蘸是三种高价值商品之一,另外两种是淀粉葡萄糖苷酶和葡萄魄糖异构酶.它们应用于食品,医药和洗涤剂工业.还是研究蛋白质和多肽结构的重要工具.在高和温度下具有活性和稳定性的蛋白酶适合生物技术的应用.嗜热微生物的酶对热稳定,但在高下不稳定,相反嗜碱微生物的酶类在碱性范围内稳定,在较高温度却非常不稳定.在我们实验室从耳霉属真菌(82.1.1)中分离出的碱性蛋白酶能代替枯草杆菌素拆分氨基酸外消旋混合物,还是胰蛋白酶的代用品用于制备动物细胞培养物.耳霉属真菌能产生高水平的碱性蛋白酶活力(30/).证明该祷包含在释放孢予的调节机制中,通过自溶形成低活力蛋白酶.还证明该碱性蛋白酶显示出宽阔的底物专一性,能与常用的洗涤剂相适应.这表明它在洗涤剂工业具有潜在的应用价值.然而,评价某种酶制荆的稳定性,一个重要因素是该酶对大范围洗涤过程温度所具有相适合的稳定性.使用某些方法防止蛋白质遇热变性,包括采用二硫键化学修饰或交联,及位点特异性突变.我们当前工作的目的是改善耳霹属菌碱性蛋白酶的热稳定性,增加作为洗涤剂添加物的效率.本文研究了化台物配伍对蛋白酶热稳定性的影响.我们的结果显示出2+和甘氨酸有效地防止热失活,能增加耳霉属真菌蛋白酶的热稳定性.二,材料和方法(一)材料麦芽汁,酵母膏,蛋白胨和琼脂由实验室提供.甘油,一葡萄糖,和尿素由本国购买.山梨醇和一8000由本国购买.乙二醇,琉基乙醇和十二烷基磺酸钠()由化学公司获得.酪蛋白购自德国.所使用其它全都化学试剂均为商品化高纯化学试剂.(二)菌种耳霉属真菌()在琼脂斜面28保存.(麦芽汁.3%,葡萄糖1.0%,酵母膏3%,蛋白胨5%,琼脂2%),(三)酶的生成将耳霉属真菌斜面接人装有100最适发酵培养基的三角瓶中.(蔗糖3%,硝酸铵0.38%,蛋白胨2%氯化钾0.2%,磷酸二氢钾0.1%,酪蛋白2%,硫酸锌0.001%,氯化钙0.001%).终7.0_-7.5,该培养物按10%接种量转接到100]相同发酵培养基中.试验摇瓶在28℃,220转培养48小时,过滤分离发酵液中的菌体和不溶性碎片.使用滤出物作为酶源.(四)酶的分析按照前报描述方法测定蛋白酶活力.2混合反应物吉有2碳酸钾一碳酸氢钾缓冲液配制的酪蛋白10,9.7,适当稀释的酶液,在37",保温0分钟.添加315%三氯醋酸中止反应,用过滤方法除去沉淀后,用分光光度计在280测定酸溶解一38—.性物质.爵活单位定义是,在37℃,每分钟使反应混合物增加1.0],所需的酶量为皿厂..伍'热稳定性的研究将5个单位酶置于.2碳酸钾一碳酸氢钾缓冲液中9.7.考察耳霉属真菌蛋白酶舶热失活.在螽加剂存在下,以所要求温度和时间周期内保温酶的方法考察添加剂对热稳定性的影响.保温终了酶置于球浴玲却15分钟,测定残余活力.在缺少添加剂时,酶在412保温的活力作为对照,假设该活力为100%.以2单位酶和不同的洗涤剂(7)和(25)在5012保温1小时测定残余酶活力的方法考察洗涤剂存在下酶的稳定性.三,结果与讨论卜)蛋白酶的热稳定性耳霉届真菌蛋白酶在室温下(28)稳定存在20小时.28显示的半衰期为105小时(图1).此酶在40",1小时内稳定,然而,在50℃保温1小时酶活力非常低.(图2)'二'-子对稳定性的帚;晌蛋白爵遏热迅速失活的重要因素之一是温度升高导致该蛋白质自溶速率增加.热敏感酶的离子结合都取代枯草菌素的自溶部位,在60℃,比野生型枯草菌素对不可逆失活的稳定性增加0倍,我们考察丁离子浓度防止耳霉属真菌蛋白酶遇热失活的影响.(图3)我们发现25的],,对尊在50℃保温小时获得最大的保护作用(22%).酶失活动力学证明蓦子的存在,该酶的半衰期由17分钟增加到47分钟.我们证明以前提及耳霉属真菌高分子蛋白酶自溶后形成低分子蛋白酶.]防止蛋白翦失活作用很低(表1),增强了=离子对自溶位点结合观点的可靠眭,离子的存在改善了耳霉属真菌蛋白酶对热失活的稳定性.表』举加物对丑霉属真菌碱性蛋白酶热稳定性的影响添加物浓度残余活力(‰)乙二醇%8甘油1%17山梨醇8004聚乙二醇-000236基乙醇100十二烷基磺酸钠0.01%一1%0氯化钠2005尿翥2—40氯化钙2522甘氨酸131氧化钙十甘氨酸;'43爵和曝加物共同在50保温小耐,按材料和方法中描述的方法测定残余酶活力,所列结果是三次重复宴验的平均值,标准误差为±1%.一39—图耳霉属碱性蛋白酶的稳定性01碳酸钾一碳酸氢钾缓冲液(9.7)含5单位酶.28℃保碾,定时取样,测定蛋白酶活力取整数,^1^,图0卯℃.和甘氯酸对碱性蛋白酶热失活的影响定时取出样品后球浴15舒钟测酶括力(0)表示在0.缓冲液中,9.7,无添加剂(●)表示舔加1甘氢酸(△表示添加25离子(三)对热箍穹性的影响己知对酶起保护作用的少数有机溶质叫,如对酶在高温.脱水,和在催化反应中无重大变化的中毒环境的保护,氨基酸,多元醇和甲胺是天然的,在酶反应过程中蛋白质遇热展开,能够重新使蛋白质再析叠丽恢复活性.在甘氨酸存在下,50℃保温1小时后耳霉属真菌蛋白酶维持31%活力,相应在缺步甘氨酸的相同条件下酶完全失活(图2).添加甘氨酸后有效增加酶在50℃的半衰期由7分钟延长到42分钟.离子和甘氨酸一起可防止酶的遇热失活,50维持相对语力43%.水是影响酶热稳定性的重要因素.糖类或多元醇能缓和非极性氨基酸当中,水和强疏水基团相互反应的结构,从而使它们抵御展开折叠和热变性.调查不同种多元醇对蛋白酶稳定性的影响.在50℃分男添加甘油(【%),乙二醇0%),和山梨醇(8),有限防止酶失活.发现的稳定效率与其分子量相关.但是一8000(200)对维持耳霉属真菌蛋白酶稳定性没有作用.因此说明多元醇对酶稳定性的影响服从于酶的亲水和疏水性质或和乙醇相互作用的程度,能推断出对酶稳定性的不合理策略,一40—(四)其它添加暂的影响通过保护酶活性位点的手段,酶对底物或抑翻物的结合很可能得到某种稳定形态.酪蛋白(0.5%)不能保护
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